常用的細(xì)菌接種方法有平板劃線分離法、斜面接種法、穿刺接種法、液體和半固體接種法、涂布接種法等。

一、平板劃線分離法

平板劃線分離法:是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面，通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。

為方便劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有分區(qū)劃線法和連續(xù)劃線法兩種（如圖1， A、B）。

圖1

分區(qū)劃線法是將平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時(shí)每次將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60~70°劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線；

另一種連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。

1）連續(xù)劃線法

接種環(huán)于酒精燈外焰燒至紅透，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環(huán)至紅。

輕輕搖勻待接種試管，左手手心托待接種試管底側(cè)部，右手執(zhí)接種環(huán)，右手小指拔下試管塞，于酒精燈附近將接種環(huán)伸進(jìn)試管，稍候，再插入待接接種液中，蘸一下，取滿一環(huán)，抽出、燒塞、蓋蓋、放回試管架?；?qū)⒔臃N環(huán)通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻，然后以無菌操作接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。

于靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環(huán)伸進(jìn)平皿，將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，輕輕涂布于瓊脂培養(yǎng)基邊緣（如圖2），抽出接種環(huán)，蓋上平皿蓋，然后將接種環(huán)上多余的培養(yǎng)液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（以免培養(yǎng)過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，鏡檢后再接種斜面。

 圖2

2）分區(qū)劃線法

取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。

分區(qū)劃線法分離時(shí)平板分四個(gè)區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120°左右。

先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3~5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60~70°，右手把接種環(huán)上多余菌體燒死，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動(dòng)約60~70°，同樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。