金黃色葡萄球菌基因敲除服務(wù)簡介

我們的金黃色葡萄球菌基因敲除載體系統(tǒng)是基于pKOR1載體而構(gòu)建的，它是一個可以在革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌中都可以啟動質(zhì)粒復(fù)制的載體，同時也是金黃色葡萄球菌同源重組載體溫度敏感型自殺質(zhì)粒。repF復(fù)制子pLE194Ts是溫度敏感性復(fù)制子，在30℃以下可以復(fù)制，在42℃以上溫度無法復(fù)制，所以通過溫度篩選的方法獲得基因缺失株；另外該復(fù)制子中還包含一段金黃色葡萄球菌重組酶基因，該基因有利有同源交換的進行。

 

優(yōu)勢

1. 溫度敏感型自殺質(zhì)粒pKOR1可做到無痕敲除。

2. 可提供修飾外源質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌：金黃色葡萄球菌RN4220是從NCTC8325的突變體中篩選得到的突變株，可以相對較高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌來源的DNA質(zhì)粒。  

3. 豐富的金黃色葡萄球菌基因敲除經(jīng)驗：可根據(jù)客戶需求選擇合適的載體，為客戶進行敲除條件的摸索及優(yōu)化。

4. 一站式服務(wù)：引物設(shè)計及優(yōu)化、基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建，敲除菌株篩選及后續(xù)處理、數(shù)據(jù)及報告整理。  

實驗方案

實驗菌株：

金黃色葡萄球菌M28A：

敲除株，BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)藥物敏感性預(yù)實驗結(jié)果，選用紅霉素抗性基因來敲除目的基因。

金黃色葡萄球菌RN4220：

ccdB Survival DB3.1：感受態(tài)。

實驗質(zhì)粒：

pKOR1：

金黃色葡萄球菌同源重組載體溫度敏感型自殺質(zhì)粒。

pMG36e：

擴增紅霉素抗性基因。

實驗準備：

提取M28A基因組、pKOR1和pMG36e質(zhì)粒，備用。

實驗方案/步驟：

一、構(gòu)建pKOR1敲除載體

1、擴增terL基因的5’和3’側(cè)翼序列及紅霉素抗性基因

50 µL反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序： 

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產(chǎn)物，測定產(chǎn)物濃度，備用。

2、融合PCR擴增TerL的5’-erm-TerL的3’片段

50 µL反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產(chǎn)物，測定產(chǎn)物濃度，備用。

3、PCR擴增構(gòu)建載體的敲除盒片段

50 µL反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產(chǎn)物，測定產(chǎn)物濃度，備用。

4、酶切質(zhì)粒

將載體進行雙酶切（KpnI、SacI），體系如下：

輕輕混勻后瞬時離心，37℃保溫 60min；回收產(chǎn)物測定濃度。

5、連接

碧云天同源重組試劑盒載體構(gòu)建

上述反應(yīng)體系置于50℃孵育15min。

6、熱激轉(zhuǎn)化ccdB Survival DB3.1

（1）吸取100μL感受態(tài)細胞液至小離心管中，加入質(zhì)粒DNA。(DNA不超過10μL, 小于50ng) 輕旋混合，置于冰上30min；

（2）42°C循環(huán)水浴，靜止放置90s；

（3）快速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻2~5min；

（4）每管加800µL LB培養(yǎng)基, 短暫回溫后，置于37°C, 180rpm搖床培育45min；

（5）吸取適量轉(zhuǎn)化后感受態(tài)細胞, 涂板于含有300µg/mL氨芐抗性的LB瓊脂平板上；

（6）將平板置于37°C恒溫暗培養(yǎng)箱中, 先正面培養(yǎng)30min, 隨后倒置培養(yǎng)。(隔夜，15h左右可見菌落)。

（7）挑取若干菌落于2mL含300µg/mL氨芐抗性的LB肉湯中培養(yǎng)，菌液進行PCR鑒定。

7、PCR鑒定與測序驗證

20 µL反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性菌落送測序驗證。測序結(jié)果與模板序列一致，則敲除載體構(gòu)建成功，進行下一階段實驗。

二、電轉(zhuǎn)化RN4220修飾敲除載體

1、提取DB3.1中的敲除質(zhì)粒；

2、制備RN4220感受態(tài)：

①　挑取單菌落于B2肉湯中在37℃過夜培養(yǎng)；

②　以1/25的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的25 mL B2肉湯中(300 mL培養(yǎng)瓶)，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；

③　離心收集菌體；

④　等體積的去離子水洗滌3次；

⑤　用1/5和1/10體積的10%甘油洗滌2次；

⑥　1/10體積的10%甘油中孵育15min；

⑦　離心后，800 µL的10%甘油重懸；

⑧　分裝70µL/份，-80℃冰箱中保存待用。

所有洗滌液和孵育條件均為20°C，所有離心均為800rpm、10 min。

3、在參數(shù)為25 μF，2.5 kV，200 ?的電轉(zhuǎn)條件下，將0.5 μg敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入RN4220感受態(tài)；

4、含25μg/mL氯霉素的BHIA篩選。

三、敲除載體電轉(zhuǎn)化M28A和初篩敲除株

1、提取RN4220中的敲除質(zhì)粒；

2、制備M28A感受態(tài)，方法同上；

3、在參數(shù)為25 μF，2.5 kV，200 ?的電轉(zhuǎn)條件下，將敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入M28A感受態(tài)細菌中，并涂板于氯霉素抗性的BHI平板上；

4、挑取平板上長出的單菌落過夜培養(yǎng)后1:100接種于5 mL不含抗生素的BHI培養(yǎng)基中；

5、42 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，再將培養(yǎng)產(chǎn)物1:100接種于5 mL不含抗生素的BHI培養(yǎng)基中，25 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；

6、重復(fù)上述步驟2次后將培養(yǎng)產(chǎn)物三線法劃線于不含抗生素的BHI平板，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；

7、挑取單菌落分別接種至含50μg/mL紅霉素的BHI平板和含25μg/mL氯霉素的BHI平板，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；

8、其中在紅霉素平板上生長，而在氯霉素平板上不生長的菌落為初篩重組成功的terL基因敲除株。

四、敲除株的鑒定

分別以初篩重組成功的terL基因敲除株染色體基因組DNA和M28A染色體基因組DNA為模板進行多重PCR鑒定。

所用引物如下表：

若初篩敲除株的鑒定結(jié)果：①為陰性，②、③、④為陽性，則證明敲除成功。