細(xì)胞培養(yǎng)的核心之一是無菌操作,那么，菌從何而來?從人、物品以及環(huán)境中來。使用一次性、已滅菌的實(shí)驗(yàn)工具，能有效降低污染引入的風(fēng)險，但總有一些工具、總有一些環(huán)節(jié)是需要反復(fù)使用的。而這就需要進(jìn)行清潔和滅菌。

Part1

選擇滅菌方法的基本原則 :

常見的2種操作是高壓滅菌和過濾除菌,主要講一下這兩者的區(qū)別和注意事項(xiàng).

滅菌方法的選擇主要基于物品在高溫下的穩(wěn)定性,可抗高溫的物品例如玻璃、金屬、耐熱塑料(PTFE)可采用干熱滅菌;

熱穩(wěn)定的液體可以采用濕熱滅菌,也就是高壓蒸氣滅菌;熱敏感的塑材可以用乙醇或射線滅菌;熱不穩(wěn)定的液體可以采用過濾除菌。

Part2

高壓滅菌 

常見的高壓滅菌方法是，使用滅菌鍋加熱水提高溫度和壓力來完成，其實(shí)驗(yàn)條件是將實(shí)驗(yàn)工具所處的環(huán)境加熱至121°并維持至少20分鐘。

由于水蒸氣會滲透至整個空間，滅菌結(jié)束后需要有一個干燥的過程，高壓蒸汽滅菌適用于熱穩(wěn)定的液體，例如水、鹽溶液、或一些成份對熱穩(wěn)定的培養(yǎng)基；例如LB，同時，這種方法也適用于耐熱的塑料，不少離心管、移液器、吸頭、吸頭盒。都是可以通過高壓來滅菌的。

使用高壓滅菌需要注意2點(diǎn):1 將含有液體的玻璃器皿進(jìn)行滅菌，如果其使用塑料蓋密封，應(yīng)在滅菌前擰松蓋子，以防滅菌過程發(fā)生爆炸;2 如果實(shí)驗(yàn)工具需要后續(xù)用于無菌操作實(shí)驗(yàn)，建議滅菌鍋所用的水使用無菌的超純水，因?yàn)闇缇^后，鍋內(nèi)有可能存在凝結(jié)水，而后者可能會存在污染帶入的風(fēng)險。

Part3過濾除菌

對于不耐熱的液體，可以使用孔徑為0.1-0.2um的微孔過濾器除菌，過濾的方法分為正壓過濾和負(fù)壓過濾，區(qū)別在于正壓過濾大多通過外力推壓針筒，使目標(biāo)液體通過濾器的濾膜后，雜質(zhì)或污染物留在膜上，液體過濾至新的容器內(nèi)。負(fù)壓過濾是通過將容器外接一個泵，利用泵把容器內(nèi)的空氣抽走，實(shí)現(xiàn)一個負(fù)壓的狀態(tài)，而液體則從容器上方往下透過濾膜流入容器內(nèi)。

使用過濾除菌，同樣有幾點(diǎn)要注意 :從操作上看使用負(fù)壓過濾會簡單不少，但由于泵在抽走空氣的同時，也會帶走容器內(nèi)的二氧化碳，因此過濾后的溶液所處的環(huán)境的pH會提高。如果是一些對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有pH要求的液體，應(yīng)該視情況補(bǔ)充二氧化碳進(jìn)容器內(nèi)。但不管是正壓還是負(fù)壓，都需要對濾器進(jìn)行質(zhì)控檢測，確保濾膜的完整性。這個質(zhì)控操作有一個專有名詞這個質(zhì)控操作有一個專有名詞。具體操作是; 當(dāng)正壓過濾完成后，所有液體已通過濾器時，提高壓力直至濾器流出物中形成氣泡，這就叫起泡點(diǎn)(bubble point)。它會在壓力是過濾壓力的兩倍多時出現(xiàn)，過濾壓力的數(shù)值可以參考產(chǎn)品說明書。如果濾器在滅菌壓力(100kPa)，或更低壓力時出現(xiàn)起泡，那么代表該濾膜已經(jīng)穿孔。在這種情況下，任何已經(jīng)收集的濾出液都應(yīng)該被認(rèn)為是未滅菌的，需要重新過濾。同時應(yīng)更換濾膜。有一些化學(xué)溶液會溶解濾膜，因此，如果要使用過濾除菌的話，應(yīng)該要提前檢查濾膜材質(zhì)是否能兼容這種化學(xué)溶液，例如DMSO，不能使用PES材質(zhì)的濾膜進(jìn)行過濾。